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Mutations of residues in the coenzyme binding pocket of Dopa decarboxylase: effect on catalytic properties  (2001)

Autori:
M. Bertoldi, C. Castellani and C. Borri Voltattorni
Titolo:
Mutations of residues in the coenzyme binding pocket of Dopa decarboxylase: effect on catalytic properties
Anno:
2001
Tipologia prodotto:
Articolo in Rivista
Tipologia ANVUR:
Articolo su rivista
Lingua:
Inglese
Referee:
Nome rivista:
European Journal of Biochemistry
ISSN Rivista:
0014-2956
N° Volume:
268
Editore:
Blackwell Science Ltd. on behalf of the Federation of European Biochemical Societies
Intervallo pagine:
2975-2981
Breve descrizione dei contenuti:
Nell’ambito degli studi riguardanti la relazione struttura-funzione della Dopa decarbossilasi sono stati ottenuti i seguenti risultati: 1. L’analisi della reazione della Dopa decarbossilasi (DDC) con la L-Dopa ha evidenziato che la perdita dell’attività decarbossilasica nel tempo si osserva a concentrazioni dell’enzima circa eguali al valore della costante di affinità, Kd, della DDC per il piridossal 5’-fosfato (PLP). Al contrario, a concentrazioni enzimatiche maggiori della Kd la formazione del prodotto procede linearmente sino al completo consumo del substrato. E’ stato inoltre evidenziato che in entrambe le condizioni sperimentali i) non si ha formazione di piridossamina 5’-fosfato (PMP); ii) la dissociazione del coenzima (che si realizza a basse concentrazioni enzimatiche) porta alla formazione dell’addotto ciclico di Pictet-Spengler PLP-L-Dopa. Questi risultati indicano che la transaminazione dipendente dalla decarbossilazione non accompagna la decarbossilazione della L-Dopa, come precedentemente proposto da O’Leary e Baughn. Ciononostante, quando si esamina la reazione della DDC con la L-Dopa in condizioni anaerobiche ad una concentrazione di enzima maggiore alla Kd si osserva che i) l’enzima va incontro ad una graduale inattivazione e l’inattivazione è associata alla formazione di PMP e ii) la velocità iniziale di decarbossilazione è circa la metà di quella in presenza di O2. Un simile comportamento si è osservato confrontando la reazione della DDC con l’5-idrossitriptofano in aerobiosi e in anaerobiosi. Pertanto la reazione della DDC con gli L-amino acidi aromatici sembra essere sotto il controllo dell’O2. Al contrario, la reattività dell’enzima con i D-amino acidi aromatici non cambia in presenza o in assenza di O2. Questi ed altri risultati da noi ottenuti precedentemente sull’effetto esercitato dall’O2 sulla specificità di reazione della DDC nei confonti delle amine aromatiche, suggeriscono un effetto produttivo dell’O2 su un complesso intermedio della reazione dell’enzima con gli L-amino acidi aromatici o le amine aromatiche. 2. Allo scopo di ottenere informazioni sul meccanismo catalitico della DDC, sono stati mutati i residui aminoacidici della DDC D271, H192, H302 e N300. Tali residui possono considerarsi potenziali partecipanti alla catalisi in quanto appartengono al comune motivo strutturale proprio delle decarbossilasi di tipo I, II e III e di altri PLP-enzimi e, come evidenziato dalla struttura della DDC da fegato di ratto ottenuta mediante “ molecular modelling”, fanno parte dei residui putativi al sito attivo. Le caratteristiche spettroscopiche dei mutanti D271E, H192Q, H302Q, e N300A così come le loro costanti di dissociazione per il PLP suggeriscono che la sostituzione di ciascuno questi residui determina alterazione sia dello stato del PLP legato che della conformazione degli amino acidi aromatici, possibilmente di quelli in vicinanza del sito attivo. Questi dati supportano, anche se non provano in modo definitivo, che i residui soggetti a mutazione sono collocati nella tasca di legame del coenzima. Inoltre, la mutazione di ciascun residuo genera una attività di decarbossilazione ossidativa nei confronti della L-Dopa, attività non rilevata nell’enzima “wild-type” in condizioni aerobiche, e diminuisce l’attività di decarbossilazione nonossidativa della L-Dopa da 3 a 390 volte. Il rapporto partizionale tra la decarbossilazione ossidativa e nonossidativa va da 5.7 x 10-4 per il mutante N300A a 946 x 10-4 per il mutante H302Q. A differenza dell’enzima “wild-type”, questi mutanti catalizzano in egual misura queste due reazioni sia in presenza che in assenza di O2. Inoltre, i 4 mutanti hanno un livello di attività di deaminazione ossidativa nei confronti delle amine aromatiche estremamente basso rispetto a quello dell’enzima “wild-type”. Nel complesso, questi dati dimostrano che sebbene i residui D271, H192, H302 e N300 non siano essenziali per la catalisi, la mutazione di questi residui altera la natura della catalisi. E’ possibile ipotizzare una possibile relazione tra l’integrità della tasca del PLP, il legame produttivo dell’O2 e la transizione ad uno stato conformazionale chiuso.
Id prodotto:
441
Handle IRIS:
11562/-441
Citazione bibliografica:
M. Bertoldi, C. Castellani and C. Borri Voltattorni, Mutations of residues in the coenzyme binding pocket of Dopa decarboxylase: effect on catalytic properties «European Journal of Biochemistry» , vol. 2682001pp. 2975-2981

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