II programma di ricerca verte sull'avanzamento delle conoscenze circa i fattori di
regolazione della formazione delle connessioni neuromuscolari. Questo è parte di un più vasto campo che è quello dello sviluppo delle connessioni nervose, cioè della formazione dei contatti sinaptici che mettono in comunicazione le cellule nervose tra di loro e con i loro organi bersaglio sia nel sistema nervoso periferico che centrale. Una delle caratteristiche salienti di tali complessi fenomeni è l'iniziale formazione di un numero sovrabbondante di sinapsi su ogni data cellula innervata, seguita da un processo di competizione tra i contatti sinaptici ed eliminazione di una buona parte di essi. Nel caso delle fibre dei muscoli scheletrici si ha che durante la vita embrionaria e quella immediatamente postnatale ciascuna di esse è innervata da più motoneuroni (innervazione polineuronale), cui segue appunto il processo di eliminazione sinaptica che porta alla situazione matura: quest'ultima è caratterizzata dalla innervazione da parte di una sola terminazione sinaptica proveniente da un unico motoneurone.
La natura dei meccanismi di competizione ed eliminazione sinaptica è assai poco conosciuta ed il sistema neuromuscolare costituisce, per la sua relativa semplicità, un eccellente modello sperimentale per il suo studio. Uno dei fattori che è più interessante sottoporre ad indagine sperimentale è il ruolo svolto dall’attività di scarica degli impulsi nervosi da parte dei motoneuroni durante lo stabilirsi dell'innervazione polineuronale e le successive fasi di competizione ed eliminazione sinaptica. Il presente è basato sulle seguenti ipotesi, tra loro peraltro strettamente connesse: 1) che l'innervazione polineuronale embrionaria sia facilitata da una scarica sincrona dei motoneuroni che vanno ad innervare ogni determinato muscolo, 2) che la successiva eliminazione sia determinata dallo stabilirsi dell'attività asincrona, che è caratteristica ben nota della scarica dei motoneuroni dell'adulto. Sono previsti diversi approcci sperimentali per sottoporre a verifica la validità di tali ipotesi.
Il modello sperimentale fondamentale è costituito innanzitutto dalla formazione di nuove sinapsi nell'animale adulto, attraverso il trapianto del moncone centrale del nervo diretto a muscoli circonvicini (nervo fibulare) sul muscolo solco di ratto, seguito dalla sezione del nervo originale. In questo modo si ha la riproduzione nell'adulto del processo di sinaptogenesi embrionaria, inclusa la iniziale innervazione polineuronale e successiva eliminazione sinaptica. Questo consente uno studio molto più agevole, ad iniziare dalle dimensioni sufficientemente grandi del soggetto sperimentale. Durante tali eventi verrà applicato un blocco di conduzione cronico (da una a quattro settimane) mediante una soluzione di tetrodotossina fatta giungere al nervo sciatico attraverso uno speciale manicotto di gomma siliconica (da costruire in laboratorio), sotto la spinta di una minipompa (Alzet, California) da applicarsi in permanenza nel sottocutaneo, sotto anestesia generale eterea. Perifericamente rispetto a questa zona di blocco verranno impiantati, sempre sotto anestesia generale, 2 speciali fili metallici isolati eccetto alla punta, posti in vicinanza del nervo sciatico, per applicare treni di stimoli elettrici atti ad evocare scariche di potenziali d'azione nei diversi assoni diretti, tra gli altri muscoli, anche a quello solco attraverso il nervo fibulare trapiantato. Tale stimolazione cronica durerà per tutto il tempo di applicazione del blocco di conduzione, nell'animale libero di muoversi a causa dell'uso di contatti elettrici rotanti (Chatam, California). In tal modo l'attività elettrica naturale, presumibilmente asincrona nei diversi assoni fibulari dopo un certo tempo dall'inizio della sinaptogenesi, verrà soppressa dal blocco ed ad essa verrà sostituita un'attività sincrona, evocata dalla stimolazione. Verrà poi investigato a tempi diversi dall'inizio dell'attività sincrona, se l'innervazione polineuronale sarà divenuta permanente per soppressione del processo di eliminazione sinaptica, come previsto dalle ipotesi sopra esposte. Questo verrà valutato sia mediante esperimenti di registrazione elettrofisiologica dei potenziali sinaptici dalle fibre del muscolo solco isolato in vitro, che mediante esperimenti di indagine morfologica al microscopio confocale. I dati ottenuti con l'ettrofisiologia saranno elaborati mediante analisi informatica su computer, mentre i secondi richiederanno la padronanza di tecniche di visualizzazione con anticorpi elettivi per le diverse strutture neuromuscolari, coniugati con traccianti fluorescenti. Essi sono anticorpi anti-sinaptofisina per le terminazione presinaptiche, anticorpi anti-neurofilamenti per gli assoni ed infine alfa-bungarotossina coniugata con rodamina per i recettori post-sinaptici per l'aceticolina.
Seguiranno altre serie sperimentali in cui si effettuerà la registrazione della modalità di scarica naturale dei motoneuroni nell'animale libero di muoversi, durante le prime 2 settimane di vita extrauterina. Questo verrà effettuato mediante sottilissimi fili isolati eccetto alla punta o microlettrodi di vetro riempiti di soluzione conducente di NaCl 4 molare, inseriti nel muscolo solco (ed altri muscoli dell'arto posteriore) al fine di registrare l'attività di scarica delle singole unità motorie. La scarica di diverse unità attive contemporaneamente nello stesso muscolo verrà analizzata su computer per verificame il grado di correlazione.
