La neutropenia severa congenita (SCN) è un difetto ereditario della granulopoiesi causato, nel 50% dei casi, da mutazioni nel gene che codifica per l’elastasi neutrofila umana (HNE). Il trattamento più comune per pazienti affetti da SCN è la somministrazione di “granulocyte-colony stimulating factor” (G-CSF); tale trattamento induce seri effetti collaterali e non cura la malattia, perché è diretto a contrastarne i sintomi piuttosto che ad eliminarne le cause. Pertanto, tentativi specifici dovrebbero essere fatti per lo sviluppo di una terapia che sia utile a lungo termine. Studi recenti hanno suggerito che la SCN possa essere considerata una malattia da “misfolding”, in quanto la maggior parte delle mutazioni patogeniche ad essa associate impediscono il corretto ripiegamento della HNE. Ciò induce una situazione di stress nella cellula che attiva un processo chiamato “unfolded protein response” la quale in ultima analisi determina apoptosi. Tuttavia, da un punto di vista biochimico, gli effetti delle sostituzioni aminoacidiche sul ripiegamento dell’elastasi non sono noti. Inoltre, sebbene sia noto che in genere le malattie da “misfolding” siano accompagnate da stress ossidativo e da meccanismi autofagici, il ruolo di tali processi nella patogenesi della SCN non è stato ancora chiarito.
Un approccio innovativo per il trattamento delle malattie da “misfolding” è l’uso di “chaperones” farmacologici, ovvero piccoli ligandi che funzionano da “stampi” per il ripiegamento di proteine mutate, inducendole ad adottare una conformazione simile a quella della proteina nativa e ripristinandone così la normale localizzazione cellulare e la funzionalità. Sono state anche proposte strategie alternative, basate sull’inibizione o dell’espressione della proteina mutata o degli eventi che seguono il “misfolding”, come l’apoptosi e/o l’autofagia. Finora tuttavia, nessuno di questi approcci è stato sviluppato per il trattamento della SCN.
Sulla base di queste considerazioni, noi proponiamo un progetto multidisciplinare avente come scopo: i) una più approfondita conoscenza dei meccanismi molecolari, energetici e cellulari mediante i quali mutazioni genetiche che causano SCN portano al “misfolding” dell’HNE e alla conseguente morte cellulare e ii) l’identificazione di nuove strategie capaci di inibire la morte cellulare di precursori dei granulociti in pazienti affetti da SCN.
La ricerca sarà portata avanti secondo le seguenti fasi:
1) DELUCIDAZIONE DEL DIFETTO MOLECOLARE DI VARIANTI PATOGENICHE DELLA HNE MEDIANTE STUDI BIOCHIMICI IN VITRO. L’HNE “wild-type” e le forme mutanti caratterizzate da un’aberrante conformazione saranno espressi in sistemi eterologhi. Mediante studi biochimici in vitro con proteine purificate, volti a chiarire il meccanismo con cui le mutazioni patogeniche influenzano la struttura e il corretto ripiegamento della HNE, saranno definiti i difetti molecolari associati con varianti patogeniche di HNE che causano SCN.
2) IDENTIFICAZIONE DI LIGANDI DI HNE POTENZIALMENTE IN GRADO DI AGIRE DA “CHAPERONES” FARMACOLOGICI.
Mediante screening in silico e test di interazione in vitro, saranno identificate piccole molecole capaci di legarsi reversibilmente alla HNE e di agire da “stampi” per il ripiegamento di mutanti della proteina incapaci di acquisire la struttura nativa. Fra tutte le molecole testate, i migliori candidati saranno scelti sulla base dell’affinità e della specificità di legame alla proteina.
3) TEST DI POTENZIALI “CHAPERONES” FARMACOLOGICI IN LINEE CELLULARI UMANE CHE ESPRIMONO VARIANTI PATOGENICHE DI HNE.
I composti identificati nella fase 2) saranno usati per trattare linee cellulari umane che esprimono HNE nella forma “wild-type” e nelle forme mutanti patogeniche. Ciò permetterà di selezionare molecole capaci di ripristinare il normale ciclo cellulare di HNE e di impedire lo stress cellulare senza indurre effetti tossici sulla cellula.
4) RUOLO DI ALTRI MECCANISMI SULLA MORTE CELLULARE INDOTTA DAL “MISFOLDING” DI HNE. In particolare, sarà valutato il ruolo dell’autofagia e/o della generazione di specie reattive dell’ossigeno sulla patogenesi della SCN.
5) TEST DI STRATEGIE CHE AGISCONO A MONTE O A VALLE DEL “MISFOLDING” DELL’HNE CAPACI DI CONTRASTARE LA MORTE CELLULARE. Saranno seguiti i seguenti approcci: i) inibizione specifica dell’espressione del gene che codifica forme mutanti di HNE mediante siRNA; ii) silenziamento della proteina omologa del fattore di trascrizione proapoptotico e proautofagico C/EBP (CHOP); iii) inibizione dello stress ossidativo generato nella cellula dall’accululo di proteine “misfolded”; iv) inibizione della morte cellulare indotta da meccanismi di tipo autofagico. Sarà anche valutato il possibile effetto sinergico della combinazione delle strategie descritte nell’impedire la morte cellulare dovuta al “misfolding” di HNE.
6) VALUTAZIONE DELL’EFFETTO DEI MIGLIORI APPROCCI IDENTIFICATI NELLE FASI 3) E 5) SU MODELLI MURINI E SU PRECURSORI GRANULOCITICI DI PAZIENTI AFFETTI DA SCN. I migliori candidati selezionati nelle fasi 3) e 5) saranno usati per il trattamento di topi transgenici che esprimono HNE “wild-type” o mutante e su neutrofili purificati da pazienti affetti da SCN. Sarà valutata l’abilità di ciascuna molecola di impedire gli effetti tossici del “misfolding” della HNE e di promuovere la sopravvivenza dei precursori granulocitici. Il modello animale servirà anche per la valutazione dei possibili effetti tossici delle molecole testate.
