Scopi:
1.Analisi della densità delle variazioni di sequenza in relazione alla loro rilevanza funzionale
2. Analisi funzionale di variazioni di sequenza in regioni critiche nei loro promotori mediante “reporter gene analysis”.
I geni COL1A1 e COL1A2, codificanti per il collagene I, la proteina piu’ abbondante in vari tessuti connettivi, fra cui pelle ed osso, sono da anni oggetto di studio del nostro gruppo. In precedenti progetti di ricerca era stato enfatizzato l’interesse per la caratterizzazione di loro mutazioni ad effetto dominante negativo, causa di Osteogenesi Imperfetta e la delineazione di correlazioni genotipo-fenotipo.
In questo progetto si vogliono prendere in considerazione degli aspetti di analisi del genoma meno direttamente legati a implicazioni cliniche.
1. Analisi della densità delle variazioni di sequenza in relazione alla loro rilevanza funzionale
Lo studio della variabilità delle regioni codificanti del nostro genoma ha ampiamente dimostrato che le singole sostituzioni nucleotidiche polimorfiche (SNPs) del tipo SameSense (SS) sono nettamente piu’ frequenti di quelle del tipo MisSense (MS). Uno screening recente dell’intera sequenza codificante del gene CFTR in un vasto campione di individui, ha dimostrato invece che, a livello sub-polimorfico (q <0.005), le frequenze di variazioni MS e SS si equivalgono: gli autori ipotizzano che l’effetto della selezione naturale nel range subpolimorfico sia superato dall’effetto della deriva genetica casuale (Modiano et al.2005). Ciò sembra verosimile per geni le cui varianti alleliche svantaggiose (patologiche) hanno effetto recessivo ( vedi CFTR), ma noi ci aspettiamo che invece in geni le cui varianti alleliche patologiche hanno effetto dominante negativo, la selezione prevalga anche a livello sub-polimorfico, penalizzando quindi le sostituzioni MS rispetto a quelle SS.
Per verificare questa ipotesi abbiamo scelto COL1A1, prototipo di gene collagenico fibrillare. La sequenza codificante corrispondente al dominio a tripla elica (3042 bp su 6728) è altamente conservata: non sono note varianti MS francamente polimorfiche, mentre >350 varianti MS sporadiche con effetto dominante negativo sono state riportate in banche dati, e sono causa di Osteogenesi Imperfetta (http:// www.le.ac.uk./genetics/collagen/index.html). Sono stati da noi analizzati 500 individui sani, per un totale di 1000 alleli. Finora abbiamo analizzato 1509 bp codificanti di cui 837 nel dominio a tripla elica e 672 nel dominio carbossiterminale. Le singole variazioni nucleotidiche individuate mediante “heteroduplex analysis” e confermate da sequenziamento, sono state quattro nel dominio a tripla elica e quattro nel dominio carbossiterminale. Le quattro variazioni nucleotidiche nel dominio a tripla elica sono del tipo same-sense (SS), ciascuna con q=0.001. Tre delle quattro variazioni nel dominio carbossiterminale sono del tipo missense (MS) e per ciascuna q=0.001; una sola è del tipo SS ed è stata trovata in tre individui (q=0.03).
I dati finora raccolti indicano, come ipotizzato, che il gene COL1A1 è assai poco variabile. Le regioni codificanti per il dominio a tripla elica appaiono “blindate”, tollerando solo mutazioni same-sense, selettivamente neutre; nella regione codificante il C-telopeptide, porzione che viene rimossa nella maturazione da procollagene a collagene maturo, sono invece riscontrabili entrambi i tipi di variazioni a livello subpolimorfico. Riteniamo necessario proseguire l’indagine al fine di estendere l’analisi sia nell’ampiezza del campione di individui sia nel n° di bp vagliate
2. Analisi funzionale di variazioni di sequenza in regioni regolatrici nei promotori dei geni collagenici mediante “reporter gene analysis”.
I promotori dei geni COL1A1 e COL1A2 sono stati studiati in dettaglio: regioni contenenti “response elements” per varie citochine sono state mappate, anche in relazione alla loro tessuto- specificità (Rossert et al.2000; Buttner et al.2004) Nei fibroblasti cutanei la regione cruciale si estende non oltre la posizione -600 rispetto al sito di inizio della trascrizione.
. Negli anni passati abbiamo raccolto biopsie cutanee da soggetti con forme lievi di Osteogenesi Imperfetta, caratterizzate da un deficit quantitativo nella produzione di collagene I. In taluni soggetti abbiamo evidenziato tale deficit a livello trascrizionale, a carico del gene COL1A1 (mutanti “allele nullo”) e abbiamo identificato alcune mutazioni causali, che implicavano un “silenziamento” funzionale dell’allele mutante: si trattava di singole sostituzioni nucleotidiche portanti a codoni di terminazione prematura (Primorac et al.2001). Restano da caratterizzare dei soggetti osteopenici (una decina) con forme “border line” di OI in cui lo screening per mutazioni nelle porzioni codificanti di COL1A1 e COL1A2 è risultato negativo; in questi intendiamo analizzare per sequenziamento la regione -600-+1 dei promotori dei due geni. Il ruolo di variazioni di sequenza eventualmente riscontrate verrà quindi vagliato con saggi funzionali (reporter gene analysis). Sequenze wild type e mutanti verranno utilizzate in costrutti di fusione con il gene reporter della luciferasi e l’attività della luciferasi verrà quantificata in fibroblasti umani trasfettati transientemente (Romanelli et al. 2005)
MATERIALI e METODI
-Preparazione di DNA genomico da sangue periferico
-Amplificazione di porzioni codificanti (tripla elica e porzione C-terminale) di COL1A1
-Screening dei prodotti di PCR mediante analisi degli eteroduplici per evidenziare variazioni di sequenza
-Sequenziamento automatico
-Colture di fibroblasti cutanei in vitro
-Studi biochimici dei collageni (collaborazione con prof.ssa Valli, Dip. Biochimica, Università di Pavia)
-Purificazione di RNA nelle frazioni nucleare e citoplasmatica
-Saggi di RT-PCR, semiquantitative e quantitative
- Amplificazione di porzioni del promotore di COL1A1 e COL1A2 da DNA selezionati, analisi degli eteroduplici, sequenziamento
- clonazione delle regioni del promotore di COL1A1 e COL1A2 nel vettore plasmidico pGL3 contenente il gene reporter per la luciferasi; trasfezione dei vettori ricombinanti prodotti in fibroblasti umani e saggi in vitro dell’attività funzionale dell’enzima luciferasi.
RISULTATI ATTESI
a) Conferma dell’ipotesi che distribuzione e frequenza di mutazioni MS e SS dipendono dalla loro localizzazione nei diversi domini funzionali del gene COL1A1
b) Messa in evidenza di variazioni di sequenza in porzioni critiche del promotore di COL1A1 e di COL1A2 che influiscono sui livelli trascrizionali dei geni.
BIBLIOGRAFIA
Buttner C, Skupin A, Rieber EP. J Cell Physiol 2004;198:248-58.
Transcriptional activation of the type I collagen genes COL1A1 and COL1A2 in fibroblasts by interleukin-4: analysis of the functional collagen promoter sequences
Modiano G, Bombieri C, Ciminelli BM, et al., Eur J Hum Genet 2005; 13:184-92. A large scale study of the random variability of a coding sequence: a study of the CFTR gene.
Rossert J, Terraz C, Dupont S, Nephrol Dial Transplant 2000; 15:66-68.
Regulation of type I collagen genes expression
Primorac D, Rowe DW, Mottes M, et al., Croatian Medical Journal 2001 ; 42:393-415
Osteogenesis Imperfecta at the beginning of bone and joint decade.
