La neutropenia severa congenita (SCN) è un difetto ereditario della granulopoiesi causato, nel 50% dei casi, da mutazioni nel gene che codifica per l’elastasi neutrofila umana (HNE). Il trattamento più comune per pazienti affetti da SCN è la somministrazione di “granulocyte-colony stimulating factor” (G-CSF); tale trattamento induce seri effetti collaterali e non cura la malattia, perché è diretto a contrastarne i sintomi piuttosto che ad eliminarne le cause. Pertanto, tentativi specifici dovrebbero essere fatti per lo sviluppo di una terapia che sia utile a lungo termine per la cura di questa malattia. Studi recenti hanno suggerito che la SCN possa essere considerata una malattia da “misfolding”, in quanto la maggior parte delle mutazioni patogeniche ad essa associate impediscono il corretto ripiegamento della HNE. Ciò induce una situazione di stress nella cellula che attiva un processo chiamato “unfolded protein response” la quale in ultima analisi determina apoptosi. Tuttavia, da un punto di vista biochimico, gli effetti delle sostituzioni aminoacidiche sul ripiegamento dell’elastasi non sono noti. Un approccio innovativo per il trattamento delle malattie da “misfolding” è l’uso di “chaperones” farmacologici, ovvero piccoli ligandi che funzionano da “stampi” per il ripiegamento di proteine mutate, inducendole ad adottare una conformazione simile a quella della proteina nativa e ripristinandone così la normale localizzazione cellulare e la funzionalità. Tuttavia, un approccio simile non è mai stato applicato al trattamento della SCN. Sulla base di queste considerazioni, noi proponiamo un progetto multidisciplinare finalizzato ad una più approfondita conoscenza dei meccanismi molecolari, energetici e cellulari mediante i quali mutazioni genetiche che causano SCN portano al “misfolding” dell’HNE e alla conseguente morte cellulare. Tali risultati costituiranno il punto di partenza per l’identificazione di possibili “chaperones” farmacologici capaci di contrastare l’effetto di mutazioni patogeniche.
La ricerca sarà portata avanti secondo le seguenti quattro fasi:
1) Analisi dell’effetto di mutazioni patogeniche che causano SCN sulle proprietà biochimiche della HNE.
HNE “wild-type” e le forme mutanti caratterizzate da un’aberrante conformazione saranno espressi in sistemi eterologhi. Mediante studi biochimici in vitro con proteine purificate, volti a chiarire il meccanismo con cui le mutazioni patogeniche influenzano la struttura e il corretto ripiegamento della HNE, saranno definiti i difetti molecolari associati con varianti patogeniche di HNE che causano SCN.
2) Identificazione di ligandi di HNE potenzialmente in grado di agire da “chaperones” farmacologici.
Mediante screening in silico e test di interazione in vitro, saranno identificate piccole molecole capaci di legarsi reversibilmente alla HNE e di agire da “stampi” per il ripiegamento di mutanti della proteina incapaci di acquisire la struttura nativa. Fra tutte le molecole testate, i migliori candidati saranno scelti sulla base dell’affinità e della specificità di legame alla proteina.
3) Test di potenziali “chaperones” farmacologici in linee cellulari umane.
I composti identificati nella fase 2) saranno usati per trattare linee cellulari umane che esprimono HNE nella forma “wild-type” e nelle forme mutanti patogeniche. Ciò permetterà di selezionare molecole capaci di ripristinare il normale ciclo cellulare di HNE e di impedire lo stress cellulare senza indurre effetti tossici sulla cellula.
4) Test di potenziali “chaperones” farmacologici su precursori granulocitici di pazienti affetti da SCN.
I migliori candidati selezionati nella fase 3) saranno usati per il trattamento di neutrofili purificati da pazienti affetti da SCN allo scopo di valutare la loro abilità di impedire gli effetti tossici del “misfolding” della HNE e di promuovere la sopravvivenza dei precursori granulocitici.
