Premessa
Il sequenziamento del genoma umano, appena completato (1), ha fornito una stima inattesa del numero di geni presenti nei nostri cromosomi: circa 30.000 a fronte di un proteoma (varieta’ complessiva delle proteine espresse) di piu’ di 90.000 proteine (2-4). Il meccanismo molecolare di regolazione dell’espressione che porta alla sintesi di varianti proteiche a partire da uno stesso gene e’ denominato processamento o splicing alternativo dell’ RNA messaggero. Il complesso meccanismo molecolare dello splicing porta alla produzione di molecole funzionali di RNA messaggero con rimozione delle sequenze non codificanti (introni) dal trascritto primario del gene. Dall’analisi delle sequenze espresse dal nostro genoma si stima che siano sottoposti a questo meccanismo di regolazione il 47% dei geni (5) e che raggiunga la sua massima attivita’ nelle cellule neuronali (6). Circa il 15% delle mutazioni puntiformi associate a malattie genetiche causano difetti dei meccanismi di processamento degli mRNA. Malattie neurodegenerative quali l’atassia teleangectasia, o di progressione tumorale quale la neurofibromatosi sono causate da alterazioni nei processi di splicing.
Il riconoscimento dei siti di splicing e’ regolato da proteine che interagiscono con elementi specifici presenti nell’RNA e l’apparato generale di splicing. Proteine ricche in serine ed arginine della famiglia SR e proteine della famiglia delle ribonucleoproteine associate all’RNA eterogeneo nucleare (hnRNP) regolano il riconoscimento dei siti di splicing (7). Negli ultimi anni il nostro gruppo di ricerca si e’ occupato dello studio genetico e strutturale di una delle proteine hnRNP: la proteina hnRNP di tipo I, anche nota come PTB (polypyrimidine tract binding-protein) per la sua affinita’ di legame con sequenze polipirimidiniche (8-11). Numerosi studi hanno evidenziato il coinvolgimento di questa proteina nella regolazione dell’espressione genica a livello post-trascrizionale come regolatore dei meccanismi di splicing tessuto specifici (12). Le evidenze sperimentali dimostrano che la proteina hnRNP I agisce come modulatore dello splicing alternativo in cellule muscolari e neuronali. Recentemente sono stati identificati due geni paraloghi di PTB, espressi prevalentemente, uno in cellule neuronali (nPTB), e l’altro in cellule ematopoietiche (ROD1) (13-14) La variante nPTB interviene come repressore dello splicing alternativo in cellule neuronali (13).
SCOPO DELLA RICERCA
Con la presente ricerca si propongono i seguenti obiettivi:
Identificazione della sequenza promotrice dell’espressione della proteina neuronale PTB.
Allo scopo di identificare gli elementi di regolazione dell’espressione della proteina neuronale PTB abbiamo isolato una sequenza genomica, a monte del primo esone del gene per nPTB, in grado di promuovere l’espressione del gene reporter luciferasi in cellule trasfettate. Identificheremo gli elementi in cis del promotore di nPTB che regolano l’espressione in cellule HeLa ed in cellule di neuroblastoma del gene reporter, utilizzando mutanti per delezione.
Isolamento e caratterizzazione di una nuova proteina della famiglia delle hnRNP.
Mediante analisi comparativa per omologia di sequenze genomiche e domini proteici funzionali, abbiamo identificato una nuova proteina della famiglia delle hnRNP espressa da un gene localizzato sul cromosoma umano 14; analizzeremo la sua espressione in tessuti umani e ne caratterizzeremo le proprieta’ strutturali funzionali.
Studio della modulazione dei processi di splicing alternativo mediato dalla proteina PTB e dall’ omologa neuronale.
Metteremo a punto saggi di splicing in vitro utilizzando minigeni soggetti a splicing alternativo. Caratterizzeremo l’effetto antagonista di proteine hnRNP ed SR sulla modulazione degli splicing alternativi mediante espressione di proteine hnRNP in cellule in coltura trasfettate.
MATERIALI E METODI
Per la realizzazione del progetto applicheremo le seguenti metodiche:
- produzione di vettori d’espressione ricombinanti contenenti separatamente:
il gene reporter luciferasi per lo studio dell’attvita’ della sequenza promotrice del gene nPTB;
il gene reporter GFP (green fluorescent protein) per lo studio dei segnali di localizzazione nucleare;
il gene per la glutatione S-transferase (GST) per gli studi di interazione proteina-proteina;
- trasfezione di colture cellulari umane, ed analisi dell’attivta’ luciferasi o della beta galattosidasi;
- analisi al miscorscopio a fluorescenza di cellule in coltura trasfettate con liposomi
- analisi di trascritti mediante RT-PCR ed analisi quantitativa dei prodotti di splicing;
- produzione di proteine ricombinanti in batteri
- GST pull down assay per l’analisi di interazione proteina-proteina.
RISULTATI ATTESI
I risultati che deriveranno dalla realizzazione del progetto contribuiranno alla migliore comprensione dei meccanismi post-trascrizionali che regolano l’espressione genica. Le informazioni potranno essere applicate, nell’ambito della biologia applicata, alla definizione degli effetti funzionali causati dalle mutazioni che alterano i processi di maturazione dell’RNA associati a malattie genetiche in studio presso la nostra sezione di Biologia e Genetica.
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HYPERLINK "http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/" www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/ Last release 14 April 2003
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