Background
L'interleuchina-6 (IL-6) è una citochina pleiotropica prodotta da molti tipi di cellule tra cui monociti/macrofagi, fibroblasti, cellule endoteliali, cheratinociti, osteoblasti, cellule T, cellule B, neutrofili, eosinofili, mastociti, cellule muscolari lisce e scheletriche [1, 2]. I principali induttori fisiologici di IL-6 sono due citochine tipicamente proinfiammatorie, il "tumor necrosis factor" (TNF) e l'interleuchina-1 (IL-1). Fino ad oggi, IL-6 è stata considerata una citochina avente essenzialmente degli effetti immunomodulatori e il suo ruolo biologico è stato limitato alla sua capacità di attivare la risposta immunitaria e i fenomeni infiammatori. Solo in anni recentissimi la scoperta dell'enorme aumento di IL-6 (circa 100 volte) nel sangue circolante in seguito a esercizio fisico, ha suggerito che IL-6 potesse svolgere un ruolo anche nella regolazione del metabolismo [3]. Sebbene inizialmente si fosse avanzata l'ipotesi che IL-6 si producesse come conseguenza ai danni muscolari determinati da un intenso esercizio, successivamente si è chiarito che IL-6 viene indotta dalla sola contrazione muscolare in assenza sia di danno muscolare che di aumentati livelli di adrenalina [4]. Inoltre, è oggi noto che le cellule responsabili dell'aumento di IL-6 nel plasma dopo esercizio fisico non sono i monociti, i maggiori produttori di IL-6 durante la sepsi, bensì le cellule del tessuto muscolare scheletrico [5, 6]. In accordo con il presupposto ruolo di IL-6 nel metabolismo e, in particolare, nell'attivazione del catabolismo, è stato dimostrato che l'ingestione di carboidrati durante l'esercizio attenua l'aumento di IL-6 nel plasma [7], mentre un basso contenuto di glicogeno induce, nel periodo successivo all'esercizio, l'espressione di mRNA di IL-6 [8].
Studi sui meccanismi molecolari responsabili dell'attivazione di IL-6 in cellule muscolari scheletriche in seguito a esercizio hanno mostrato l'implicazione della via di trasduzione del segnale del Ca2+, che attiverebbe il fattore di trascrizione NFAT il quale da solo o in cooperazione con AP1 indurrebbe il gene di IL-6 a livello trascrizionale [9].
D'altro canto, invece, i meccanismi molecolari che determinano la regolazione del metabolismo da parte di IL-6 non sono a tutt'oggi ancora stati chiariti. Si è osservato che IL-6 può avere un ruolo sia nel metabolismo glicidico che in quello lipidico. Alcuni studi mostrano che l'infusione di IL-6 ricombinante in soggetti umani determina un aumento della disponibilità di glucosio e della sua ossidazione da parte dell'intero organismo [10], mentre altre evidenze sperimentali non mostrano alcuna variazione dei livelli di glucosio in seguito a infusione di IL-6 [11]. Risultati chiari sono invece stati ottenuti sul metabolismo lipidico con l'osservazione dell'esistenza di una stretta correlazione tra aumento di IL-6 endogena o ricombinante, a dosi che non influenzano i livelli delle catecolammine e del glucagone, e aumento di acidi grassi circolanti [12]. Questo risultato, insieme alla osservazione che topi deficienti di IL-6 sviluppano una precoce obesità [13], indica che IL-6 potrebbe essere classificato come un nuovo ormone lipolitico che agisce in modo simile ad altri ormoni neuro-endocrini.
Obiettivo
Il presente progetto di ricerca si propone di caratterizzare i meccanismi molecolari che sono alla base dell'aumentata lipolisi a carico del tessuto adiposo determinata dalla produzione di IL-6 in seguito a esercizio fisico.
Descrizione del progetto
La scoperta della presenza di recettori per IL-6 e della capacità di produrre IL-6 da parte di adipociti in coltura [14] permette di formulare l'ipotesi per cui la lipolisi indotta da IL-6 in seguito a esercizio preveda l'attivazione di una via di traduzione del segnale che porti all'induzione della lipasi ormonosensibile (HSL). Tale enzima, la cui funzione fisiologica è l’idrolisi dei trigliceridi nel tessuto adiposo, viene normalmente sintetizzato dagli adipociti e attivato con fosforilazione reversibile dai livelli ematici di catecolammine [15]. Poco è noto riguardo alla regolazione trascrizionale del gene della HSL. Il suo promotore è stato sequenziato e caratterizzato per la presenza di alcuni siti di legame per fattori di trascrizione tra cui USF-1, USF-2, Sp1 e Sp3 [16]. Inoltre, un'analisi di omologia di sequenza con siti noti di riconoscimento per fattori di trascrizione rivela la presenza nelle 800 basi a monte del sito di inizio di trascrizione del gene di numerose sequenze consenso per AP-2, c-Myc, C/EBP, CP1, GR, NF-1, IRF-2, LF-A1.
Per studiare la regolazione dell'espressione del gene della HSL da parte di IL-6 noi stiamo utilizzando la linea cellulare di pre-adipociti murini NIH3T3-L1 che esprime HSL. Dopo trattamento delle cellule in coltura con IL-6, l'RNA totale viene purificato e su di esso sono valutati i livelli di RNA messaggero specifico per HSL, in paragone al controllo non trattato, con il metodo del "Northern blot" o della PCR quantitativa o semiquantitativa. Esperimenti preliminari di PCR hanno mostrato che IL-6 induce un aumento del mRNA di HSL di circa due volte, suggerendo che la citochina sia in grado di attivare la trascrizione del gene HSL.
In questo secondo anno di lavoro è nostra intenzione caratterizzare il meccanismo trascrizionale utilizzando il promotore del gene della HSL che è stato clonato utlizzando DNA genomico estratto da linee cellulari umane. Tale promotore, inserito in un opportuno vettore contenente come gene reporter quello della luciferasi, sarà trasfettato nelle cellule NIH3T3-L1. Mutazioni per delezione e mutazioni puntiformi del promotore, insieme con esperimenti di "band shift" (EMSA), ci permetteranno di mappare i siti di risposta all'IL-6. In parallelo, sarà valutata l'attività della HSL al fine di definire se IL-6 ha la capacità di indurre l'enzima anche a livello post-traduzionale.
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