Uniformità e diversità degli enzimi dipendenti dal piridossale 5'-fosfato: studi strutturali e funzionali su enzimi appartenenti alla stessa famiglia evolutiva

Data inizio
5 novembre 2002
Durata (mesi) 
24
Responsabili (o referenti locali)
Voltattorni Carla

La nostra Unità si propone di continuare lo studio della Dopa Decarbossilasi e di intraprendere la caratterizzazione di un altro PLP-enzima, la Cistalisina, della stessa classe strutturale della DDC (tipo I) ma che, a differenza della DDC, catalizza una reazione al C anziché al Cα.
  1. Dopa Decarbossilasi
    L’obiettivo principale che si propone la nostra Unità é la comprensione del meccanismo catalitico delle varie reazione catalizzate dalla DDC e il ruolo dei residui che partecipano a tali processi. Data la recente risoluzione della struttura 3D dell’enzima si ha intenzione di intraprendere studi mirati di mutagenesi sito-specifica. In particolare, si intende:
    • mutare la K303 che lega il PLP e che in molti PLP-enzimi è coinvolta nelle reazioni di deprotonazione/riprotonazione al C4’ o al C di intermedi della catalisi. Dal momento che la DDC catalizza parecchie reazioni, tale mutazione potra’ permettere di discriminare il ruolo che la K303 gioca nei diversi processi di catalisi;
    • deletare l’ansa che è sito di lisi delle proteasi sostituendo i residui mancanti con residui di glicina in modo da mantenere invariata la lunghezza dell’ansa ma non la sequenza dei residui;
    • sottoporre a mutazione, Y332 e K334, residui dell'ansa che, sulla base della struttura 3D della DDC in presenza di un analogo del substrato, dovrebbero collocarsi in seguito al legame con il substrato in prossimità del sito attivo.
  2. Cistalisina
    Il compito della nostra Unità consiste principalmente nello studio del meccanismo chimico e catalitico della reazione, nella comprensione del ruolo dei residui coinvolti e nella ricerca e progettazione di inibitori efficaci e selettivi.
    Allo scopo di ottenere informazioni sui requisiti strutturali e funzionali essenziali per il legame e/o per la catalisi ci proponiamo di:
    • studiare il meccanismo di reazione della cistalisina in presenza di vari substrati solforati, oltre alla cisteina, per determinare la specificità di reazione e substrato;
    • identificare intermedi catalitici allo stato pre-stazionario e stazionario;
    • studiare la reazione di eliminazione nei confronti della cisteina in funzione del pH per ottenere informazioni sui valori di pK di possibili residui implicati nel legame e/o nella catalisi. Inoltre, data l’importanza che tale enzima riveste nelle patologie periodontali, una volta determinati gli elementi strutturali fondamentali si passerà alla progettazione razionale e alla sperimentazione di potenziali inibitori specifici.

Enti finanziatori:

Ministero dell'Istruzione dell'Università e della Ricerca
Finanziamento: assegnato e gestito da un ente esterno all'ateneo
Programma: FIRB

Partecipanti al progetto

Mariarita Bertoldi
Professore associato
Silvia Bianconi
Tecnico-Amministrativo
Pubblicazioni
Titolo Autori Anno
Reaction and substrate specificity of recombinant pig kidney Dopa decarboxylase under aerobic and anaerobic conditions. Bertoldi M., Voltattorni BC. 2003
Treponema denticola cystalysin exhibits significant alanine racemase activity accompanied by transamination: mechanistic implications Bertoldi M, Cellini B, Paiardini A, Di Salvo M, Voltattorni BC. 2003

Attività

Strutture