Studio dell'influenza degli Human T-cell Leukemia viruses (HTLV-I e II) sui meccanismi che regolano la proliferazione e la morte cellulare nelle cellule ematopoietiche

Starting date
September 25, 2004
Duration (months)
36
Managers or local contacts
Bertazzoni Umberto

PREMESSA
I retovirus umani HTLV-! E II presentano una struttura genetica complessa e ben definita e sono responsabili di diverse malattie linfoproliferative, neurologiche ed immunologiche che sono in aumento sia nei paesi in via di sviluppo che nei paesi industrializzati. L’HTLV-I è l’agente eziologico dell’adult T-cell Leucemia e di una malattia neurodegenerativa nota come tropical spastic paraperesis. L’HTLV-II è presente soltanto nei tossicodipendenti ed è stato messo in relazione a diversi casi di malattie linfoproliferative e neurodegenerative anche se non è stato ancora ben chiarito il suo possibile ruolo nella causa di una specifica malattia.

Studi recenti compituti dal nostro gruppo di ricerca hanno dimostrato che l’HTLV-II agisce bloccando il processo apoptotico a cui vanno incontro in vitro i precursori ematopoietici CD£$+ in assenza di IL-3. Questo effetto non richiede l’infezione della cellula da parte del virus, è accompagnato da un effetto fitogenico diretto ed è mediato dalle molecole di classe II presenti sulla membrana virale. Studi ulteriori da noi compiti hanno permesso di stabilire che HTLV-II promuove la secrezione di CC-chemochine, in particolare MIP-1alfa, in colture cellulari ottenute da individui infettati. Abbiamo potuto inoltre dimostrare che l’interazione HTLV-II/cellule34+ porta ad un aumento dell’espressione di citochine, in particolare IFNg e GM-CSF, che inducono l’attivazione di STAT1 e STAT5 e possono influenzare la capacità rigenerativa delle cellule ospiti e la risposta immune a HTLV-II e ad altri agenti infettivi, incluso HIV-1.

Abbiamo inoltre dimostrato che l’HTLV-II up-regola l’attività telomerasica nelle cellule CD34+, aumentandone la potenzialità replicativi e la sopravvivenza. I risultati ottenuti sono di particolare interesse e sollevano una serie di interrogativi sulla identificazione dei fattori che proteggono le CD34+ dall’apoptosi e sulla comprensione del meccanismo che porta all’attivazione della telomerasi da parte del virus.

Studi ulteriori, condotti sia in cellule B che in cellule T, ci hanno permesso di stabilire cha la suscettibilità all’infezione da HTLV-II è inversamente proporzionale all’spressione di CIITA, che rappresenta il più importante fattore di regolazione della trascrizione dei geni HLA di classe II.
L’azione di CIITA è mediata attraverso l’inibizione dell’attività transattivante della proteina Tax di HTLV-II sulle LTR.

L’interazione tra HTLV e cellule CD34+ rappresenta un modello molto promettente per studiare gli effetti degli stimoli virali su target cellulari specifici. La comprensione di questi fenomeni potrà gettare luce sui meccanismi che portano a riarrangiamenti nell’espressione genica della cellula ospite e alla de-regolazione dei normali processi cellulari.

Lo studio degli effetti biologici dei HTLV sulle Cd34+ sarà attuato sia su cellule CD34+ isolate da celule mononucleate di sangue periferico (PBMC) di soggetti sani che sulla linea cellulare TF-1.

L’infezione da HTLV induce gravi disfunzioni del sistema immunitario, tra cui la proliferazione spontanea dei linfociti T, di cui si ritiene sia il principale responsabile la proteina trans-regolatoria Tax. Infatti, oltre ad agire sulle sequenze virali LTR, Tax è in grado di trans-attivare sia i promotori di geni eucaristici eterologhi coinvolti nell’attivazione e proliferazione dei linfociti T, sia una gran numero di geni codificanti per le citochine. Questo obiettivo di ricerca si propone di studiare la funzione e la struttura della proteina Tax di HTLV-II (TaxII) che non è ancora stata oggetto di studi approfonditi dato che non sono ancora stati ottenuti degli anticorpi in grado di riconoscere in modo specifico la proteina stessa.

SCOPO E METODOLOGIA

Lo scopo principale di questa ricerca è quello di sfruttare la capacità dei retrovirus oncogeni umani HTLV nel determinare effetti molecolari e cellulari specifici che conducono alla de-regolazione di processi cellulari complessi e alla possibile insorgenza di uno stato patologico. Come si è verificato nel caso di altri virus, lo studio degli effetti cellulari legati alla interazione virus/cellula è in grado di far luce su alcuni meccanismi particolarmente rilevanti dal punto di vista biologico e patologico e chiarire la patogenesi di malattie umane.

La prima parte del progetto sarà dedicata allo studio della regolazione dell’espressione di CIITA/Tax in una linea cellulare di tipo B, BJAB, prima e dopo l’infezione con l’HTLV. L’espressione delle molecole di membrana HLA-II sarà analizzata mediante citometria a flusso e utilizzando anticorpi specifici contro isotopi della classe II. L’espressione delle proteine CITA e RFX (fattore di regolazione per X-box) sarà esaminato nelle cellule BJAB e in cellule BJAB infettate da HTLV mediante analisi RT-PCR dei trascritti mRNA. Il meccanismo di espressione CIITA sarà studiato analizzando il pattern di mutilazione del suo promotore. L’interazione tra la proteina Tax-II e il CIITA sarà studiato analizzando l’immunoprecipitato ottenuto transfettando il gene tax-II in cellule HeLa insieme ad attivatori cellulari trascrizionali delle LTR virali (P/CaF e CBP/p300).
La seconda parte del progeto prenderà in considerazione l’identificazione di fattori indotti da HTLV-II nei precursori ematopoietici, l’attivazione della telomerasi e l’espressione di Bcl-2/Bcl-XL. La regolazione dell’espressione delle subunità della telomerasi sarà studiata analizzando i livelli quantitativi di mRNA nelle cellule TF-1 e l’attività telomerasica e la lunghezza dei telomeri sarà esaminata per mezzo del saggio TRP e citometria a flusso. Al fine di comprendere se Bcl-2 e Bcl-XL siano responsabili dell’effetto anti-apoptotico indotto da HTLV, l’espressione di queste proteine sarà sottoposta a regolazione utilizzando oligonucleotidi antisenso. Il meccanismo dell’induzione della telomerasi da perte del virus sarà investigato analizzando il mRNA di hTERT per mezzo di PCR quantitativa e in concomitanza con la down-regulation di Bcl2 o di Bcl-XL.
La terza parte del progetto riguarda l’analisi dei domini strutturali della proteina Tax II coinvolti nell’interazione con fattori cellulari che regolano il trasporto nucleare e l’identificazione delle modificazioni post-traduzionali della proteina che determinano l’inteerazione con altri fattori cellulari di regolazione dell’espressione genica. Il gene per la proteina Tax II è stato clonato nel vettore plasmidico pEGFP-C1, in grado di esprimere in cellule eucaristiche la proteina fluorescente naturale GFP( green fluorescent protein) di Aequoria visctoria. Questo vettore d’espressione si presta allo studio della localizzazione intracellulare dei prodotti di fusione con la proteina GFP che manca di segnali specifici di localizzazione. Si procederà inoltre al clonaggio ed all’espressione, sia in cellule batteriche che in quelle di mammifero, del gene tax di HTLV-II, al fine di ottenere la proteina Tax-II purificata che potrà essere utilizzata per la preparazione di anticorpi policlonali e monoclinali di topo. Questi anticorpi specifici permetteranno di condurre una serie di studi immunologici mirati alla comprensione della localizzazione cellulare di Tax-II e all’identificazione della sua espressione in specifici stati patologici umani legati alla proliferazione di cellule ematopoietiche.

RISULTATI ATTESI
L’analisi dei segni virali che sono in grado di indurre l’attivazione della telomerasi e l’espressione di Bcl-2 in cellule CD34+ ci permetterà di identificare i fattori specifici che proteggono le cellule TF-1 dall’apoptosi.
La comprensione dell’effetto inibitorio esercitato dal CITA mediante l’azione di Tax sulle LTR permetterà di chiarire il meccanismo di regolazione e di espressione di CTIIA nelle cellule BJAB prima e dopo l’infezione da HTLVII.
La comprensione del meccanismo di regolazione del trasporto intracellulare della proteina Tax II consentirà di individuare domini strutturali della proteina che possono essere bersagli di inibitori chimici

Sponsors:

Funds: assigned and managed by the department

Project participants

Umberto Bertazzoni
Carlo Bidoia
Paola Rossolillo
Marco Turci

Collaboratori esterni

Paola Righi
Università di Verona Dipartimento Materno-Infantile e Biologia Genetica

Activities

Research facilities