Reelin: meccanismo di azione e funzione nello sviluppo e plasticità del sistema nervoso. Nuove prospettive per la prevenzione e terapia del disturbo autistico

Starting date
November 21, 2003
Duration (months)
48
Departments
Neurosciences, Biomedicine and Movement Sciences
Managers or local contacts
Cangiano Alberto

Il compito dell’UR 4 e’ di studiare il ruolo di reelin nei processi di sinaptogenesi, sulla giunzione neuromuscolare (n-m) per le seguenti ragioni:
  1. la sinapsi n-m e’ un modello classico, sulla cui struttura e funzione esistono moltissimi dati non solo nell’adulto ma anche durante lo sviluppo embrionario e la vita post-natale precoce;
  2. l’UR 1 ha trovato espressione di reelin nel muscolo scheletrico di topo a P10. Il Western blot ne ha rivelato la presenza nel reeler eterozigote (rl/+), non nell’omozigote (rl/rl). L’esatta localizzazione e’ da chiarire. Puo’ essere espressa nelle fibre muscolari, nelle terminazioni motoneuronali o in entrambe;
  3. l’espressione (o co-espressione) motoneuronale e’ incerta. Non vi sono dati di immunoistochimica nel midollo spinale ma solo di ibridizzazione in situ, concordanti sulla presenza di reelin nelle corna anteriori durante lo sviluppo. Alcuni rilevano reelin in interneuroni, altri nei neuroni più grandi. L’UR 1 esaminera’ sezioni longitudinali di midollo all’immunofluorescenza con anticorpo monoclonale 142 che consente una ottima visualizzazione, per dirimere la questione. L’espressione di reelin nel muscolo e’ pero’ certa;
  4. nel fenotipo reeler e’ presente, oltre al tremore, grave ipotonia muscolare e cosi’ pure nel quadro umano di lissencefalia ed autismo con difetto di reelin nel quale sono segnalate alterazioni delle connessioni n-m (6);
  5. è stata identificata dalle UR 1 e 3 un’attivita’ enzimatica di reelin di tipo serin-proteasico con azione sulla matrice extracellulare. Attivita’ proteasiche sono state implicate in vari processi relativi alla sinaptogenesi sia durante lo sviluppo (ruolo attribuito alla serin-proteasi ‘trombina’ nella eliminazione sinaptica n-m durante la prima vita post-natale da Liu et al. che nell’adulto (ruolo della serin-proteasi ‘tissue Plasminogen Activator’ nella neosinaptogenesi che si ha nelle fasi tardive dell’LTP ippocampale. Appare quindi possible che durante lo sviluppo reelin venga o secreta dai motoneuroni o piu’ probabilmente prodotta dalle fibre muscolari, e giochi un ruolo durante i processi di costruzione (sinaptogenesi) e rimodellamento (eliminazione sinaptica) delle giunzioni n-m.
Gli approcci saranno i seguenti:
  1. studio della sinaptogenesi embrionaria nel topo reeler visualizzando con sonde fluorescenti i componenti fondamentali della sinapsi n-m: recettori post-sinaptici per l’acetilcolina (alfa-bungarotossina rodaminata) e terminazioni presinaptiche (anticorpi anti-neurofilamenti ed anti-sinaptofisina fluorescinati) iniziando da E13. Mediante microscopia a fluorescenza (normale e confocale) verra’ misurata l’area della terminazione motoria e dell’aggregato dei recettori per l’acetilcolina e determinato il loro rapporto. Una variante di questo studio sara’ rappresentata dall’incrocio di topi reeler (partendo dall’eterozigote, fenotipicamente normale) con topi i cui motoneuroni sono costitutivamente fluorescenti perche’ esprimenti GFP (green fluorescent protein) in diverse linee. Nella linea YFP-16 tutti i motoneuroni sono fluorescenti a partire da E10 consentendo cosi’ una visualizzazione ottimale dei primi contatti sinaptici. Nella linea YFP-H l'espressione inizia invece a P6-7 ed in pochissimi assoni (uno o due) per muscolo, permettendo la visualizzazione di singole unita’ motorie, in muscoli interi, la determinazione della loro grandezza e le possibili alterazioni nel reeler.
  2. studio dell’eliminazione sinaptica nel topo reeler nel periodo P1-15, mediante analisi elettrofisiologica intracellulare degli input sinaptici multipli o singoli su ogni data fibra muscolare. Nel normale alla nascita ogni fibra e’ innervata da piu’ motoneuroni mentre gia’ a P15 si e’ avuta l’eliminazione degli input ridondanti, stabilendosi cosi il quadro adulto di innervazione da un solo motoneurone.
  3. applicazione in topi normali dell’anticorpo monoclonale CR-50 che neutralizza reelin, sia nell’embrione durante la sinaptogenesi che nel neonato durante il periodo di eliminazione sinaptica: questo consente di studiare gli effetti della mancanza di reelin sulla sinaptogenesi n-m in assenza di alterazioni di struttura e funzione del SNC, che invece si hanno nel reeler. Questo e’ particolarmente importante perche’ nel reeler si ha tremore, e quindi un’attivita’ abnorme, di tipo sincrono, dei motoneuroni. Questo tipo di attivita’e’ stata mostrata recentemente dall’UR 4 modificare notevolmente l'andamento temporale della eliminazione sinaptica in modelli di reinnervazione del muscolo soleo di ratto adulto normale. Se fosse difficile l’applicazione dell’anticorpo CR-50 nell’embrione o nel neonato per le piccole dimensioni, essa verra’ eseguita nell’adulto, in un modello di reinnervazione del muscolo soleo da parte di un nervo estraneo trapiantato su una regione non-sinaptica dopo sezione del nervo proprio. Le maggiori dimensioni consentono la perfusione cronica in vivo della zona di neo-sinaptogenesi con cannula rifornita da pompa osmotica. Tutti gli esperimenti con anticorpo CR-50 possono essere fatti oltre che in topi anche in ratti, gli animali essendo normali, per facilitarne l’esecuzione;
  4. esame delle connessioni n-m in topi reeler knock-in prodotti dall’UR 1, in cui reelin e’ privata dell’attivita’ proteasica.

Sponsors:

Ministero dell'Istruzione dell'Università e della Ricerca
Funds: assigned and managed by an external body
Syllabus: FIRB

Project participants

Carlo Bidoia
Mario Rosario Buffelli
Associate Professor
Giuseppe Busetto
Assistant Professor
Alberto Cangiano
Research Assistants
Morgana Favero
Daniele Molinari
Technical-administrative staff
Marco Veronese
Technical-administrative staff

Activities

Research facilities